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干細(xì)胞誘導(dǎo)的人小腸上皮模型用于藥物吸收的體外研究
來源：蘇州北科納米 瀏覽 1516 次 發(fā)布時(shí)間:2022-09-16
小腸（hSI）是人類重要的器官，執(zhí)行著包括消化在內(nèi)的眾多功能，包括但不限于初始和選擇性屏障活動(dòng)、營(yíng)養(yǎng)吸收、宿主-微生物相互作用，以及宿主防御和免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)。口服給藥是最常見的給藥方式，許多藥物在小腸中被吸收并開始代謝。過去十年，研究者嘗試總結(jié)體內(nèi)腸道復(fù)雜生理功能的各個(gè)方面，并利用人類結(jié)腸腺癌細(xì)胞系（Caco-2）以及人工膜系統(tǒng)，來建立評(píng)估藥物在小腸中的吸收和代謝的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｈ欢F(xiàn)有的模型無法充分模擬hSI的功能，也無法反映藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體、藥物代謝酶和緊密連接的表達(dá)模式所扮演的重要作用。此外，這些模型中缺乏細(xì)胞色素P450酶(CYP3A4)，而hSI中最豐富的藥物代謝酶正是P450，這導(dǎo)致了Caco-2模型不適合研究腸道首過效應(yīng)和生物利用度。近年來，原代人腸上皮細(xì)胞（hIEC）模型的發(fā)展取得了顯著進(jìn)展，例如3D人體腸道類器官（hIOs）。但由于人體腸道類器官內(nèi)缺乏增殖細(xì)胞群，難以將腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)成融合的單分子層，因此從人體腸道類器官生成單層hSI模型十分困難。
鑒于此，韓國(guó)生命工學(xué)研究院的一項(xiàng)研究開發(fā)了一種重復(fù)性良好的兩步方法來誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞分化為可擴(kuò)大的hIEC祖細(xì)胞和具有功能性的hIEC單層細(xì)胞。
為了從人多功能干細(xì)胞（hPSCs）中獲得單層hSI模型，研究者建立了一種新的定向分化方案，來模擬體內(nèi)腸道發(fā)育過程。該方案采用激活素A（Activin A）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、Wnt信號(hào)通路激動(dòng)劑R-spondin 1和胰島素等來誘導(dǎo)hPSCs向hIEC祖細(xì)胞分化，并進(jìn)一步分化為有功能性的hIEC。經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間傳代后（大于10代，培養(yǎng)大于5個(gè)月），腸細(xì)胞標(biāo)記物和緊密連接分子的表達(dá)沒有明顯變化，腸上皮功能相關(guān)實(shí)驗(yàn)同樣使用Transwell系統(tǒng)。
圖1｜由hPSCs分化hIECs的過程與相關(guān)表征
由于在hSI中，Wnt的抑制和Notch的激活有助于祖細(xì)胞分化為吸收前上皮細(xì)胞，研究者使用了Wnt信號(hào)抑制劑Wnt-c59和Notch信號(hào)激動(dòng)劑丙戊酸(VPA)，來進(jìn)一步將hIEC祖細(xì)胞分化為與體內(nèi)類似的成熟且有功能的hIEC。與其他僅由吸收性腸細(xì)胞組成的小腸上皮模型相比，該系統(tǒng)可以模擬體內(nèi)樣腸組織進(jìn)行研究。與未成熟的hIECs相比，功能性hIECs形成了一個(gè)結(jié)構(gòu)極化的單層，并觀察到了類似杯狀細(xì)胞分泌出的粘液。此外，功能性單分子層hIEC的頂表面接觸的細(xì)菌數(shù)量明顯更高，并且黏液蛋白和黏液蛋白相關(guān)基因的表達(dá)在功能性hIEC中顯著增加能夠允許腸道微生物群的持續(xù)定植。
圖2｜功能性hIECs單層模型的結(jié)構(gòu)與功能表征
隨后，研究分析了各種腸道轉(zhuǎn)運(yùn)體和代謝酶的表達(dá)水平，通過RNA測(cè)序與酶活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)腸道堿性磷酸酶（IAP）和CYP3A4在功能性hIEC中表達(dá)量相當(dāng)高，這些結(jié)果表明功能性hIEC具有藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體和藥物代謝酶活性，是評(píng)價(jià)藥物體外生物利用度所必需的。本研究使用了6種臨床藥物：美托洛爾、普萘洛爾、雙氯芬酸、雷尼替丁、呋塞米和紅霉素，進(jìn)行體外藥物吸收試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與Caco-2模型不理想的體內(nèi)外相關(guān)性相比，功能性hIEC與已公布的人體內(nèi)腸道吸收數(shù)據(jù)擬合的相關(guān)性良好，說明功能性hIEC可以更好地預(yù)測(cè)人的口服生物利用度和吸收程度。
圖3｜6種臨床模型藥物在功能性hIECs與Caco-2模型上吸收的擬合結(jié)果
總而言之，此研究發(fā)明了一套可靠且完善的hIECs培養(yǎng)系統(tǒng)，可以用來產(chǎn)生具有接近體內(nèi)功能的小腸上皮單層，以取代目前的體外模型，提供一個(gè)新的通用的藥物體外腸吸收的檢測(cè)平臺(tái)。