2.結果與分析

2.1 pH對PPP-NP粒徑和Zeta-電位的影響

蛋白質熱聚集顆粒的形成是蛋白質分子之間的靜電和疏水相互作用的一種競爭現象。當蛋白質溶液中的親水基團能夠提供足夠的排斥力時，蛋白質的聚集就會停止。相反，當疏水基團的作用很強時，會給蛋白質的聚集帶來動力。粒徑和多分散性系數（Polydispersity index，PDI）測量通常用于表征溶液中的聚合物聚集情況；Zeta-電位用于表征溶液的電負性，分析溶液中分子間的靜電相互作用。研究表明，蛋白質分子之間的作用力不僅與它們自身的特性有關，而且還取決于外部的加工環境條件。

圖1A測定了不同pH對PPP-NP粒徑的影響。

如圖1A所示，PPP-NP的粒徑在45~120 nm之間，在pH6.5時，PPP溶液的粒徑在110 nm左右，且擁有最低的PDI（0.19），表明PPP在pH6.5下形成的PPP-NP是分布最均一的。由圖1B可知，PPP-NP電位的絕對值隨著pH的增加而增大，大豆蛋白熱聚集體也有相同的趨勢。在pH4.0時，Zeta-電位值為正，主要是由于此時pH<5.5（PPP的等電點（Isoelectric point，pI）為5.5），溶液帶正電荷；當pH≥6.5時，Zeta-電位的絕對值隨pH增大的原因是此時溶液距離pI越來越遠，攜帶更多的負電荷。綜上所述，在pH6.5下PPP-NP粒徑最大，為110 nm。且PDI值最低，說明在此pH下，PPP-NP的粒徑分布集中，分散性好。

2.2 PPP-NP的表面形貌

用場發射掃描電子顯微鏡研究的PPP-NP的形態如圖2所示。根據粒徑結果，可得出pH6.5下PPP-NP的PDI值低，粒徑分布集中，因此以pH6.5制備的PPP-NP為代表。由圖2A所示，此條件下PPP-NP尺寸均勻。在圖2B放大5萬倍下更為清晰地觀察到這一現象。顆粒尺寸大小和分布情況符合圖2A的結果。這些PPP-NP以適當的尺寸制造以穩定Pickering乳液。

由圖2A可知PPP-NP的粒徑大小在45~120 nm之間，較小的顆粒具有較快的吸附動力學，它們可以更快更準確地吸附在水包油界面上，從而使界面得到更大程度的填充，從而形成更穩定的Pickering乳液。均一的粒徑分布和低PDI值是穩定Pickering乳液的關鍵。在pH6.5下制備的PPP-NP不僅粒徑分布均勻一致，并且兼具吸附動力學優勢，因此具有更高的應用價值。

2.3 pH對PPP-NP二級結構的影響

使用遠紫外圓二色光譜測量pH對PPP-NP二級結構的影響。圖3為圓二色光譜圖，表1為二級結構的定量分析。由表1可知，PPP含有α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲四種二級結構組分：α-螺旋和β-折疊代表蛋白質的有序結構；β-轉角和無規卷曲則代表蛋白質的無序結構。與未經任何處理的對照（control group，con）相比，在調節pH后經過加熱的樣品，α-螺旋結構含量顯著減少約19.2%~34.5%，β-折疊含量顯著增加6.9%~47.2%，無規卷曲含量降低8.7%~20.2%。α-螺旋減少的原因是由于熱處理會導致α-螺旋中的氫鍵損傷，而氫鍵是穩定蛋白質二級結構的主要作用力。

β-折疊含量增加是由于熱處理能打開蛋白結構，暴露疏水性基團，增強了蛋白質間的相互作用，進而通過分子間β-折疊形成蛋白聚集體。與中性和堿性條件相比，酸性（pH4.0）條件下的α-螺旋含量較低，這可能是由于α-螺旋主要是由氫鍵穩定的，而PPP的pI約5.5，此時蛋白是帶負電荷，酸性環境可能會增加由于電荷中和而增加蛋白質之間的靜電作用力，從而影響氫鍵的穩定性。靜電作用力和氫鍵的變化會導致酸性條件下α-螺旋的損失。研究表明，其他來源的蛋白二級結構變化也有相似的規律，例如，Wu等將蕓豆蛋白進行低pH熱處理，蛋白結構發生變形和重組，從而使β-折疊含量增加。在pH6.5~8.0范圍內，α-螺旋和β-折疊含量變化不顯著，說明在此范圍內的pH的變化不足以引起蛋白質二級結構的變化。并且，在此范圍內，pH6.5下PPP-NP的β-折疊含量相對最高。已經有相關研究表明，β-折疊含量的增加可能會提高顆粒的界面吸附能力。因此，pH6.5下PPP-NP具有較強的降低界面張力能力，這與后面的界面吸附特性實驗結果相互論證。

2.4 pH對PPP-NP界面吸附特性的影響

由于從乳液界面去除吸附顆粒需要巨大的解吸能量，因此顆粒的界面吸附被認為是一個不可逆的過程。PPP-NP在油-水界面的吸附可能包括至少兩個階段：第一階段PPP-NP接近乳液界面并滲透到油-水界面，第二階段顆粒附著在界面，導致粘彈性界面膜的形成。由于乳化劑的界面特性是評估其穩定乳液能力的關鍵因素，因此測定了不同pH條件下PPP-NP的界面張力的變化。

如圖4所示，所有樣品在前200 s內界面張力值急劇下降，這是由于PPP-NP開始附著在油水界面上。界面張力的快速下降是PPP-NP具有有效乳化劑的一個基本特征。隨后，界面張力值下降速度減慢直至達到平衡，這是由于顆粒在油水界面的堆積和結構重排，接近平衡狀態意味著顆粒即將終止分子構象的重排。在所有pH條件下，界面張力值均隨著時間的推移而降低，表明PPP可以在各種pH條件下在油水界面處吸附。界面張力的降低會降低吉布斯表面自由能，從而提高界面層的穩定性。與con相比，所有樣品的最終平衡值均小于con，這可能是由于con未經加熱處理，而實驗組在熱處理過程中球狀蛋白質的展開（以及疏水部分的暴露）的結果，說明PPP-NP的乳化性優于PPP。有些蛋白加熱聚集后降低界面張力的能力增加，因此穩定油水界面能力增強，乳化性和乳化穩定性改善。