1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PPP的純化

參考文獻(xiàn)的方法純化PPP。將噴霧干燥的PPP粉末溶解在超純水中配制成10.0%（w/v）的蛋白溶液，在4℃條件下10000 r/min離心15 min以除去不溶性雜質(zhì)，用透析袋（截留分子量為7 kDa）對上清液進(jìn)行透析。最后將透析液冷凍干燥即獲得PPP，密封后置于4℃保存?zhèn)溆谩?

1.2.2不同pH下PPP-NP的制備

取1.2.1制備獲得的PPP配制1%（w/v）的PPP溶液，室溫300 r/min攪拌2 h，冰箱中靜置過夜，充分水合，然后在4℃條件下10000 r/min、15 min離心取上清液，調(diào)節(jié)pH至4.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在85℃水浴加熱20 min后，立即4℃冰水浴冷卻，獲得不同pH的PPP-NP的穩(wěn)定懸浮液。同時(shí)設(shè)置對照樣品，不做任何處理。

1.2.3粒徑和Zeta-電位測定

粒徑和Zeta-電位由Nano ZS+MPT-2 Malvern納米粒度分析儀測定。參考文獻(xiàn)的方法，并稍作修改。用相應(yīng)pH的超純水稀釋至0.4 mg/mL，在25℃下平衡120 s后測定。

1.2.4表面形貌觀察

將1.2.2制備的懸浮液使用液氮進(jìn)行速凍后，再對其進(jìn)行冷凍干燥獲得樣品粉末備用，將樣品粉末均勻分散于導(dǎo)電膠上，使用場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察樣品的表面形貌。

1.2.5圓二色光譜分析

參考文獻(xiàn)的方法，并在其基礎(chǔ)上修改。用相應(yīng)pH的超純水將1.2.2制備的懸浮液稀釋至1 mg/mL。利用0.1 cm的石英比色皿，在190~240 nm的波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，取三次掃描結(jié)果的平均值生成數(shù)據(jù)。

1.2.6界面張力測定

使用Tracker界面流變儀測量了不同pH的PPP-NP降低油水界面張力的能力。參考文獻(xiàn)的方法，稍作修改。將1.2.2制備的PPP-NP用相應(yīng)pH的超純水稀釋10倍，然后添加到一個(gè)光學(xué)玻璃樣品皿中（40 mm×40 mm×30 mm），油相MCT添加到U型注射器（彎曲G18，內(nèi)徑0.84 mm，長度10 cm）。在恒定的油滴體積下，監(jiān)測了6000 s內(nèi)界面張力值的變化，直到達(dá)到平衡。所有測量均在25℃下進(jìn)行。

1.2.7不同pH下PPP-NP穩(wěn)定的Pickering乳液的制備

將1.2.2制備的懸浮液與油相（MCT）按體積比9:1混合，先高速剪切3 min形成粗乳液，再75 MPa高壓均質(zhì)制備Pickering乳液。

1.2.8乳液的粒徑測定

使用Mastersizer 2000激光粒度儀測定乳液液滴的大小和分布情況。測定乳液液滴的大小和分布情況。參考文獻(xiàn)的方法，測定前使乳液與分散劑（去離子水）充分混勻后進(jìn)行測試，其中樣品折射率設(shè)置為1.47，分散劑折射率為1.33；泵速為2000 r/min。液滴的大小用體積加權(quán)平均粒徑（Volume-weighted diameter，d4,3）表示。其中計(jì)算公式如下：

式中：di表示油滴直徑，μm；ni表示直徑為di的油滴數(shù)量。

1.2.9乳液表觀粘度的測定

通過安東帕MCR92流變儀中帶有的不銹鋼板和板的幾何測量單元（pp-25，直徑25 mm）對乳液的表觀粘度進(jìn)行測量。參考文獻(xiàn)的方法并加以修改。將制備的新鮮乳液放置在兩個(gè)平行板之間，間隙高度設(shè)置為1 mm。在0.1~1000 s?1的剪切速率范圍內(nèi)進(jìn)行剪切掃描，研究乳液表觀粘度的變化。

1.2.10乳液的儲藏穩(wěn)定性

參考文獻(xiàn)的方法并加以修改。將新鮮制備的乳液（20 mL）轉(zhuǎn)移到30 mL玻璃瓶中，然后在45℃進(jìn)行加速實(shí)驗(yàn)，定期監(jiān)測乳液的視覺外觀、粒徑和電位的變化，觀察其儲存穩(wěn)定性。

1.2.11乳液的微觀結(jié)構(gòu)

采用LEICA SP8共聚焦激光掃描顯微鏡觀察乳液的微觀結(jié)構(gòu)。參考文獻(xiàn)的方法并稍加修改。將20μL的尼羅紅（2 mg/mL，溶于異丙醇）加入到1 mL乳液中，充分混勻完成染色。取染色后的乳液10μL涂在顯微鏡載玻片上，然后用蓋玻片覆蓋。在488 nm（Ar-Kr激光器）激發(fā)波長下，在25℃下采集物鏡放大倍數(shù)為63×，像素為1024×1024的乳液顯微圖像，并在45℃的加速儲藏條件下定期監(jiān)測其乳液微觀結(jié)構(gòu)的變化。

1.2.12多重光散射

利用多重光散射技術(shù)通過測定穩(wěn)定性指數(shù)（Turbiscan stability index，TSI）和相對背散射光（Relative backscattered light，ΔBS）的變化來評估Pickering乳液的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)過程中，將新鮮制備的乳液（20 mL）轉(zhuǎn)移到其樣品瓶中，要求乳液不能有氣泡，儀器平衡后立即進(jìn)行測定。設(shè)置掃描程序?yàn)?5℃掃描48 h，每1 h進(jìn)行一次掃描，通過儀器所帶軟件得到Pickering乳液的整體TSI值變化情況以及ΔBS隨時(shí)間的變化曲線。通過樣品的掃描圖譜變化情況，分析乳液的穩(wěn)定性。

1.3數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，結(jié)果之間的差異用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Standard deviation，SD）表示，使用Origin Pro 2017對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 23進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用Duncan檢驗(yàn)分析樣品之間差異的顯著性，并且在P<0.05時(shí)定義顯著差異。