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界面張力儀測(cè)定不同pH值下椰子球蛋白的界面張力變化

來(lái)源:香料香精化妝品省部共建創(chuàng)新中心等整編 瀏覽 101 次 發(fā)布時(shí)間:2025-06-16

海南大學(xué)Jingrong Ma課題組為了更好地了解椰子球蛋白(CG)在不同pH下的乳化機(jī)制,研究了不同pH(3-11)未加熱和加熱(90℃,30 min)條件下的界面行為與乳液穩(wěn)定性(O/W)之間的關(guān)系。CG的動(dòng)態(tài)界面張力在pH為11時(shí)最低,其次是pH為9、3、7和5。CG在pH值為5時(shí)界面吸附效果最好,但在pH值為11時(shí)界面出現(xiàn)解吸情況。各組在加熱后吸附量均下降。pH為5時(shí)的CG具有最高的擴(kuò)張彈性模量(Ed),其次是pH為3、7、9和11。加熱CG的Ed趨勢(shì)與未加熱樣品一致,但明顯降低。在高頻和振幅擾動(dòng)下,pH為11處的CG具有較高的膨脹模量(E)。CG表現(xiàn)出更好的界面行為,有助于提高pH 3時(shí)的乳液穩(wěn)定性。闡明界面行為與乳化液穩(wěn)定性的關(guān)系對(duì)促進(jìn)CG作為乳化劑的應(yīng)用具有重要意義。


動(dòng)態(tài)界面張力測(cè)量方法


一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備


1.儀器與試劑


儀器:Kibron界面張力儀(含Wilhelmy板或Du Noüy環(huán)、恒溫水浴模塊、自動(dòng)進(jìn)樣器)、pH計(jì)(精度±0.01)、電子天平(稱量蛋白)、磁力攪拌器、離心機(jī)(可選)、移液槍(1-1000μL)、燒杯/樣品池(潔凈無(wú)污染)。


試劑:椰子球蛋白(純度≥90%,建議分子量10-50 kDa)、超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm)、緩沖溶液(如PBS緩沖液,pH范圍5.0-9.0,離子強(qiáng)度0.01-0.1 M,避免干擾蛋白質(zhì)吸附)、稀鹽酸/氫氧化鈉(調(diào)節(jié)pH)。


二、操作步驟


步驟1:儀器預(yù)熱與校準(zhǔn)


開機(jī):連接電源,打開Kibron界面張力儀主機(jī)及軟件(如DeltaFlow或Kibron Control),啟動(dòng)恒溫水浴模塊(設(shè)置目標(biāo)溫度,通常25±0.1℃,界面張力受溫度影響顯著)。


校準(zhǔn):


Wilhelmy板法:使用標(biāo)準(zhǔn)液體(如超純水,25℃時(shí)γ≈72 mN/m)校準(zhǔn)。將潔凈的Wilhelmy板(鉑片,尺寸約10×20 mm,邊緣垂直)安裝到傳感器上,確保板面無(wú)劃痕、無(wú)油脂(可用乙醇擦拭后灼燒冷卻)。在軟件中輸入標(biāo)準(zhǔn)液體的表面張力值,儀器自動(dòng)校準(zhǔn)位移傳感器與力的關(guān)系。


Du Noüy環(huán)法(若使用):校準(zhǔn)環(huán)的周長(zhǎng)(需測(cè)量環(huán)的內(nèi)外徑,計(jì)算平均周長(zhǎng)),并用已知表面張力的液體驗(yàn)證準(zhǔn)確性。


步驟2:椰子球蛋白樣品制備


溶解:稱取一定量椰子球蛋白(如10 mg),加入5-10 mL對(duì)應(yīng)pH的緩沖液(如pH 7.0的PBS),磁力攪拌(300 rpm)或漩渦振蕩15-30 min,至完全溶解(避免劇烈攪拌產(chǎn)生氣泡)。


pH調(diào)節(jié):用1 M HCl或NaOH溶液逐滴調(diào)節(jié)蛋白溶液pH至目標(biāo)值(如pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0),每次調(diào)節(jié)后靜置2 min,用校準(zhǔn)過(guò)的pH計(jì)測(cè)量確認(rèn)(插入深度≥1 cm,避免界面干擾)。


脫氣(可選):若溶液含溶解氣體(如空氣),可將樣品置于真空干燥器中10-15 min,減少界面氣泡(氣泡會(huì)導(dǎo)致界面張力測(cè)量值偏高)。


步驟3:界面張力測(cè)量


安裝樣品池:將清潔的樣品池(玻璃或聚四氟乙烯材質(zhì),內(nèi)徑≥50 mm)置于儀器樣品臺(tái)上,用移液槍注入20-30 mL待測(cè)蛋白溶液(液面高度需覆蓋Wilhelmy板浸入深度,通常≥20 mm)。


安裝Wilhelmy板:手動(dòng)或自動(dòng)將Wilhelmy板緩慢浸入樣品池,確保板面與液面垂直,且邊緣剛好接觸液面(軟件提示“板接觸液面”后停止)。


平衡等待:?jiǎn)?dòng)測(cè)量程序,儀器自動(dòng)記錄界面張力隨時(shí)間的變化。蛋白質(zhì)需在界面上吸附達(dá)到平衡(通常5-30 min,具體時(shí)間需預(yù)實(shí)驗(yàn)確定,觀察數(shù)據(jù)趨于穩(wěn)定后停止)。


數(shù)據(jù)采集:平衡后,軟件自動(dòng)記錄穩(wěn)定的界面張力值(γ),每個(gè)pH條件重復(fù)測(cè)量3次(更換新鮮樣品),取平均值。


步驟4:清洗與切換樣品


測(cè)量完一個(gè)pH樣品后,用去離子水或下一個(gè)pH緩沖液沖洗樣品池和Wilhelmy板3次(避免交叉污染)。


若板面有殘留蛋白,可用軟毛刷輕刷鉑片(避免刮傷),再用乙醇擦拭后灼燒(僅適用于耐高溫鉑片)。

三、注意事項(xiàng)


1.pH調(diào)節(jié)的關(guān)鍵控制


蛋白質(zhì)的界面張力對(duì)pH敏感(尤其接近等電點(diǎn)pI時(shí),電荷減少,疏水性增強(qiáng)),需精確調(diào)節(jié)pH(建議使用微量移液槍逐滴添加,并充分混勻)。


避免pH調(diào)節(jié)劑過(guò)量(如HCl/NaOH濃度過(guò)高可能破壞蛋白質(zhì)構(gòu)象),推薦使用0.1 M緩沖液儲(chǔ)備液稀釋至目標(biāo)離子強(qiáng)度(如0.01 M)。


2.蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性


椰子球蛋白在極端pH(如pH<5或>9)可能變性沉淀,需通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定其穩(wěn)定pH范圍(通常接近生理pH 5-7)。若出現(xiàn)沉淀,需離心(10,000×g,10 min)去除,取上清測(cè)量(沉淀可能干擾界面吸附)。


蛋白質(zhì)濃度需適宜(建議0.1-1 mg/mL):濃度過(guò)低時(shí)界面吸附量不足,界面張力偏高;過(guò)高可能導(dǎo)致界面膜過(guò)厚,吸附動(dòng)力學(xué)復(fù)雜。


3.儀器清潔與污染防控


Wilhelmy板需保持絕對(duì)潔凈(任何油脂或灰塵會(huì)導(dǎo)致界面張力測(cè)量值偏差),使用前可用鉻酸洗液浸泡(10%H?CrO?)10 min,再用超純水沖洗并干燥。


樣品池每次使用后需用去離子水沖洗,避免殘留鹽類或蛋白質(zhì)吸附(尤其高離子強(qiáng)度緩沖液易在池壁結(jié)垢)。


4.溫度與界面穩(wěn)定


界面張力隨溫度升高顯著降低(約每℃下降0.1-0.2 mN/m),需使用恒溫水浴嚴(yán)格控制溫度(誤差±0.1℃),并在測(cè)量時(shí)等待樣品與儀器溫度平衡(約5 min)。


避免環(huán)境溫度波動(dòng)(如空調(diào)風(fēng)直吹),可在儀器周圍放置隔熱罩。


5.數(shù)據(jù)可靠性驗(yàn)證


每次測(cè)量前檢查Wilhelmy板的濕潤(rùn)性(浸入純水后應(yīng)能自動(dòng)吸附,無(wú)氣泡附著)。若板面疏水,可用稀表面活性劑(如0.01%SDS)浸泡清洗(僅限玻璃板,鉑片禁用)。


預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證蛋白質(zhì)在界面的吸附行為:通過(guò)動(dòng)態(tài)界面張力曲線(γ-t)判斷是否達(dá)到平衡(斜率趨近于0),若長(zhǎng)時(shí)間不穩(wěn)定(如持續(xù)下降),可能是蛋白質(zhì)未完全溶解或溶液中有雜質(zhì)。

結(jié)果


Kdiff、Kp和Kr的最高值分別為pH值7、3和5。柔性蛋白可以在油水界面上更快地吸附和重新排列。pH為3時(shí)CG靈活的二級(jí)結(jié)構(gòu),使其具有更好的吸附動(dòng)力學(xué),。pH 5(接近pI 4.3)的CG更弱的靜電斥力,引起了更好的結(jié)構(gòu)重排。加熱后,除pH值為5時(shí)CG的Kdiff外,所有樣品的Kdiff、Kp和Kr均有所下降。加熱后的CG具有較低的初始界面張力和較短的平衡吸附時(shí)間(圖1a),它能迅速達(dá)到平衡狀態(tài),并且吸附動(dòng)力學(xué)指數(shù)較低。此外,加熱后的CG表現(xiàn)出顯著的變性和聚集,殘留的蛋白質(zhì)分子會(huì)產(chǎn)生空間位阻,從而阻礙聚集后的CG到達(dá)油水界面。此外,不溶性CG聚集體對(duì)殘留CG分子的吸附產(chǎn)生了屏障。CG在pH為5時(shí),蛋白質(zhì)形成大量沉淀,溶解度僅為12.05%。可溶性蛋白含量低意味著較弱的靜電排斥力,這使剩余的蛋白更容易擴(kuò)散,從而導(dǎo)致最高的Kdiff。與動(dòng)態(tài)界面張力相比,CG與pH 5T的吸附動(dòng)力學(xué)不受蛋白質(zhì)濃度的影響。


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